Подвижная фаза эквивалентна жидкой фазе крови., и есть разные вещи, на которые следует обратить внимание во время использования. Среди них есть некоторые «подводные камни», на которые необходимо обратить внимание.
01. Измерьте pH подвижной фазы после добавления органического растворителя.
Если вы измеряете pH с помощью органической добавки, полученное значение pH будет отличаться от того, которое было до добавления органического растворителя. Однако самое главное — быть последовательным. Если вы всегда измеряете pH после добавления органического растворителя, обязательно укажите свои действия в используемом вами методе, чтобы другие следовали тому же методу. Этот метод не является на 100% точным, но, по крайней мере, он сохранит его последовательность. Это может быть более важным, чем получение точного значения pH.
02. Буфер не используется
Цель буфера — контролировать pH и предотвращать его изменение. Многие другие методы изменяют pH подвижной фазы, что может вызвать сдвиги времени удерживания, формы пика и отклика пика.
Муравьиная кислота, TFA и т. д. не являются буферами.
03. Неиспользование буфера в нормальном диапазоне pH.
Каждый буфер имеет ширину диапазона pH в 2 единицы, в пределах которой он обеспечивает наилучшую стабильность pH. Буферы за пределами этого окна не обеспечат эффективную устойчивость к изменениям pH. Либо используйте буфер в правильном диапазоне, либо выберите буфер, который охватывает необходимый вам диапазон pH.
04. Добавьте буфер в органический раствор.
Смешивание буферного раствора с органической фазой, скорее всего, приведет к осаждению буфера. Во многих случаях, даже если осадки и выпали, их все равно сложно обнаружить. Не забывайте всегда добавлять органический раствор к водной фазе, что может значительно снизить вероятность буферного осаждения.
05. Смешайте насосом градиент концентрации от 0%.
Доступные сегодня насосы могут эффективно смешивать подвижные фазы и проводить дегазацию в линии, но не каждый, кто использует ваш метод, будет иметь высококачественный насос. Смешайте A и B в один раствор и запустите его на 100 % в потоке.
Например, 950 мл органической исходной смеси можно приготовить путем смешивания с 50 мл воды. Преимущество этого заключается в том, что это может уменьшить вариабельность результатов ВЭЖХ и уменьшить вероятность образования пузырьков и осадков в системе. Стоит отметить, что соотношение помповой смеси составляет 95:5, что не означает, что время удерживания предварительно смешанной смеси в бутылке также составляет 95:5.
06. Неиспользование правильной модифицированной кислоты (основания) для замены буфера.
Используйте только ту кислоту или основание, которые образуют буферную соль, которую вы используете. Например, натрий-фосфатный буфер следует готовить только из фосфорной кислоты или гидроксида натрия.
07. Не указание всей информации о буфере в методе, например добавление 5 гфосфат натрия на 1000 мл воды.
Тип буфера определяет диапазон pH, который можно буферизовать. Требуемая концентрация определяет силу буфера. 5 граммов безводного фосфата натрия и 5 граммов моногидрата монофосфата натрия имеют разную буферную силу.
08. Добавление органических растворителей перед проверкой
Если в предыдущем методе использовался буферный раствор для базовой линии B, а в вашем методе используется органический раствор для базовой линии B, вы можете надеяться, что буферный раствор будет помещен в трубки и головку насоса.
09. Поднимите бутылку и вылейте последнюю каплю.
Существует большая вероятность того, что вам не хватит подвижной фазы для завершения всего анализа, и ваш образец закоптит. Помимо возможности сгорания насосной системы и колонки, подвижная фаза полностью испарится, а подвижная фаза в верхней части бутыли изменится.
10. Используйте подвижную фазу ультразвуковой дегазации.
Самый важный момент — убедиться, что все буферные соли растворены, но это худший способ дегазации, поскольку он быстро нагревает подвижную фазу, вызывая испарение органических компонентов. Чтобы избежать ненужных проблем в дальнейшем, потратьте пять минут на вакуумную фильтрацию подвижной фазы.
Время публикации: 27 августа 2024 г.