Жидкостная хроматография является основным методом проверки содержания каждого компонента и примесей в сырье, промежуточных продуктах, препаратах и упаковочных материалах, но для многих веществ нет стандартных методов, на которые можно было бы положиться, поэтому разработка новых методов неизбежна. При разработке жидкофазных методов хроматографическая колонка является основой жидкостной хроматографии, поэтому выбор подходящей хроматографической колонки имеет решающее значение. В этой статье автор объяснит, как выбрать колонку для жидкостной хроматографии по трем аспектам: общие идеи, соображения и сфера применения.
A.Общие идеи по выбору колонок для жидкостной хроматографии
1. Оцените физические и химические свойства аналита: такие как химическая структура, растворимость, стабильность (например, легко ли его окислить/восстановить/гидролизовать), кислотность и щелочность и т. д., особенно химическая структура является ключевым моментом. фактор, определяющий свойства, такой как сопряженная группа имеет сильное поглощение ультрафиолета и сильную флуоресценцию;
2. Определите цель анализа: требуется ли высокое разделение, высокая эффективность колонки, короткое время анализа, высокая чувствительность, устойчивость к высокому давлению, длительный срок службы колонки, низкая стоимость и т. д.;
- Выберите подходящую хроматографическую колонку: изучите состав, физические и химические свойства хроматографического наполнителя, такие как размер частиц, размер пор, температурная устойчивость, устойчивость к pH, адсорбция аналита и т. д.
- Рекомендации по выбору колонок для жидкостной хроматографии
В этой главе будут обсуждаться факторы, которые следует учитывать при выборе хроматографической колонки с точки зрения физических и химических свойств самой хроматографической колонки. 2.1 Матрица наполнителя
2.1.1 Матрица силикагеля Матрицей-наполнителем большинства колонок для жидкостной хроматографии является силикагель. Этот тип наполнителя имеет высокую чистоту, низкую стоимость, высокую механическую прочность и легко модифицируется группами (такими как фенильная связь, аминная связь, циановая связь и т. д.), но значение pH и диапазон температур, которые он переносит, ограничены: Диапазон pH большинства наполнителей матрицы силикагеля составляет от 2 до 8, но диапазон pH специально модифицированных фаз, связанных силикагелем, может достигать 1,5-10, а также существуют специально модифицированные фазы, связанные силикагелем, которые стабильны при низком pH. такой как Agilent ZORBAX RRHD Sustainablebond-C18, который стабилен при pH от 1 до 8; верхний предел температуры матрицы силикагеля обычно составляет 60 ℃, а некоторые хроматографические колонки могут выдерживать температуру 40 ℃ при высоком pH.
2.1.2 Полимерная матрица Полимерными наполнителями чаще всего являются полистирол-дивинилбензол или полиметакрилат. Их преимущества заключаются в том, что они могут переносить широкий диапазон pH – их можно использовать в диапазоне от 1 до 14, и они более устойчивы к высоким температурам (могут достигать выше 80 °C). По сравнению с наполнителями C18 на основе диоксида кремния этот тип наполнителя обладает более сильной гидрофобностью, а макропористый полимер очень эффективен при разделении таких образцов, как белки. Его недостатки заключаются в том, что эффективность колонны ниже, а механическая прочность слабее, чем у наполнителей на основе кремнезема. 2.2 Форма частиц
Большинство современных наполнителей для ВЭЖХ представляют собой сферические частицы, но иногда они имеют неправильную форму. Сферические частицы могут обеспечить более низкое давление в колонке, более высокую эффективность, стабильность и более длительный срок службы колонки; при использовании подвижных фаз высокой вязкости (например, фосфорной кислоты) или когда раствор пробы вязкий, частицы неправильной формы имеют большую удельную поверхность, что более способствует полному действию двух фаз, а цена относительно низкая. 2.3 Размер частиц
Чем меньше размер частиц, тем выше эффективность колонки и выше степень разделения, но тем хуже устойчивость к высокому давлению. Наиболее часто используемой колонкой является колонка с размером частиц 5 мкм; если требования к разделению высоки, можно выбрать наполнитель размером 1,5–3 мкм, что способствует решению проблемы разделения некоторых сложных матриц и многокомпонентных образцов. UPLC может использовать наполнители размером 1,5 мкм; Наполнители с размером частиц 10 мкм и более часто используются для полупрепаративных или препаративных колонок. 2.4 Содержание углерода
Содержание углерода относится к доле связанной фазы на поверхности силикагеля, которая связана с удельной площадью поверхности и покрытием связанной фазы. Высокое содержание углерода обеспечивает высокую емкость колонки и высокое разрешение и часто используется для сложных проб, требующих высокого разделения, но из-за длительного времени взаимодействия между двумя фазами время анализа увеличивается; Хроматографические колонки с низким содержанием углерода имеют более короткое время анализа и могут проявлять различную селективность и часто используются для простых проб, требующих быстрого анализа, и проб, требующих условий с высоким содержанием водной фазы. Обычно содержание углерода C18 колеблется от 7% до 19%. 2.5 Размер пор и удельная поверхность
Адсорбционные среды для ВЭЖХ представляют собой пористые частицы, и большинство взаимодействий происходит в порах. Следовательно, молекулы должны проникнуть в поры для адсорбции и разделения.
Размер пор и удельная поверхность — два взаимодополняющих понятия. Малый размер пор означает большую удельную поверхность, и наоборот. Большая удельная площадь поверхности может усилить взаимодействие между молекулами образца и связанными фазами, улучшить удерживание, увеличить загрузку образца и емкость колонки, а также разделение сложных компонентов. К этому типу наполнителей относятся полностью пористые наполнители. Для тех, у кого высокие требования к сепарации, рекомендуется выбирать наполнители с большой удельной поверхностью; небольшая удельная поверхность может снизить противодавление, повысить эффективность колонки и сократить время равновесия, что подходит для градиентного анализа. К этому типу наполнителей относятся наполнители типа «ядро-оболочка». Для обеспечения разделения рекомендуется выбирать наполнители с небольшой удельной поверхностью для тех, у кого высокие требования к эффективности анализа. 2.6 Объем пор и механическая прочность
Объем пор, также известный как «объем пор», относится к размеру объема пустот на единицу частицы. Он хорошо отражает механическую прочность наполнителя. Механическая прочность наполнителей с большим объемом пор несколько слабее, чем у наполнителей с малым объемом пор. Наполнители с объемом пор менее или равный 1,5 мл/г в основном используются для разделения ВЭЖХ, тогда как наполнители с объемом пор более 1,5 мл/г в основном используются для молекулярно-эксклюзионной хроматографии и хроматографии низкого давления. 2.7 Ставка ограничения
Кэпирование может уменьшить хвостовые пики, вызванные взаимодействием между соединениями и открытыми силанольными группами (например, ионной связью между щелочными соединениями и силанольными группами, силами Ван-дер-Ваальса и водородными связями между кислотными соединениями и силанольными группами), тем самым улучшая эффективность колонки и форму пиков. . Непокрытые связанные фазы будут иметь различную селективность по сравнению с закрытыми связанными фазами, особенно для полярных образцов.
- Область применения различных колонок для жидкостной хроматографии
В этой главе в некоторых случаях описывается область применения различных типов колонок для жидкостной хроматографии.
3.1 Обращенно-фазовая хроматографическая колонка C18
Колонка C18 является наиболее часто используемой колонкой с обращенной фазой, которая может соответствовать тестам на содержание и примеси большинства органических веществ и применима к среднеполярным, слабополярным и неполярным веществам. Тип и характеристики хроматографической колонки C18 следует выбирать в соответствии с конкретными требованиями к разделению. Например, для веществ с высокими требованиями к разделению часто используются спецификации 5 мкм*4,6 мм*250 мм; для веществ со сложной матрицей разделения и аналогичной полярностью можно использовать размеры частиц 4 мкм*4,6 мм*250 мм или меньшие размеры. Например, автор использовал колонку 3 мкм*4,6 мм*250 мм для обнаружения двух генотоксичных примесей в АФИ целекоксиба. Разделение двух веществ может достигать 2,9, что является отличным показателем. Кроме того, в целях обеспечения разделения, если требуется быстрый анализ, часто выбирают короткую колонку диаметром 10 или 15 мм. Например, когда автор использовал ЖХ-МС/МС для обнаружения генотоксической примеси в API пиперахинфосфата, использовалась колонка 3 мкм*2,1 мм*100 мм. Разделение примеси и основного компонента составило 2,0, а обнаружение образца можно завершить за 5 минут. 3.2 Фенильная колонка с обращенной фазой
Фениловая колонка также является разновидностью колонны с обращенной фазой. Колонки этого типа обладают высокой селективностью в отношении ароматических соединений. Если отклик ароматических соединений, измеренный обычной колонкой C18, слабый, можно рассмотреть возможность замены фенильной колонки. Например, когда я готовил целекоксиб API, реакция основного компонента, измеренная с помощью фенильной колонки того же производителя и той же спецификации (все 5 мкм*4,6 мм*250 мм), была примерно в 7 раз выше, чем у колонки C18. 3.3 Колонка нормальной фазы
В качестве эффективного дополнения к колонке с обращенной фазой колонка с нормальной фазой подходит для высокополярных соединений. Если пик по-прежнему очень быстрый при элюировании более 90% водной фазы в колонке с обращенной фазой и даже близок к пику растворителя и перекрывается с ним, можно рассмотреть возможность замены колонки с нормальной фазой. Колонки этого типа включают в себя хиликовую колонку, аминоколонку, цианоколонку и т. д.
3.3.1 Колонка Hilic Колонка Hilic обычно включает гидрофильные группы в связанную алкильную цепь для усиления реакции на полярные вещества. Колонки этого типа подходят для анализа сахаристых веществ. Автор использовал этот тип колонки при определении содержания и родственных веществ ксилозы и ее производных. Изомеры производного ксилозы также можно хорошо разделить;
3.3.2 Аминоколонка и цианоколонка Аминоколонка и цианоколонка относятся к введению амино- и циано-модификаций на конце связанной алкильной цепи соответственно для улучшения селективности в отношении специальных веществ: например, аминоколонка является хорошим выбором. для разделения сахаров, аминокислот, оснований и амидов; Циановая колонка обладает лучшей селективностью при разделении гидрированных и негидрированных структурно близких веществ за счет наличия сопряженных связей. Колонку с аминокислотами и колонку с циано часто можно переключать между колонкой с нормальной фазой и колонкой с обращенной фазой, но частое переключение не рекомендуется. 3.4 Хиральная колонка
Хиральная колонка, как следует из названия, подходит для разделения и анализа хиральных соединений, особенно в области фармацевтики. Колонку этого типа можно рассматривать, когда обычные колонки с обращенной фазой и нормальной фазой не могут обеспечить разделение изомеров. Например, автор использовал хиральную колонку 5 мкм*4,6 мм*250 мм для разделения двух изомеров 1,2-дифенилэтилендиамина: (1S,2S)-1,2-дифенилэтилендиамина и (1R,2R)-1,2. -дифенилэтилендиамина, и разделение между ними достигало примерно 2,0. Однако хиральные колонки дороже, чем колонки других типов, обычно 1 Вт+/шт. Если есть необходимость в таких колонках, подразделению необходимо заложить достаточный бюджет. 3.5 Ионообменная колонка
Ионообменные колонки подходят для разделения и анализа заряженных ионов, таких как ионы белков, нуклеиновых кислот и некоторых сахаристых веществ. По типу наполнителя они делятся на катионообменные, анионообменные и сильные катионообменные.
Катионообменные колонки включают колонки на основе кальция и водорода, которые в основном подходят для анализа катионных веществ, таких как аминокислоты. Например, автор использовал колонки на основе кальция при анализе глюконата и ацетата кальция в промывочном растворе. Оба вещества имели сильный отклик при λ=210 нм, а степень разделения достигала 3,0; автор использовал водородные колонки при анализе веществ, родственных глюкозе. Несколько основных родственных веществ – мальтоза, мальтотриоза и фруктоза – имели высокую чувствительность при дифференциальных детекторах с пределом обнаружения всего 0,5 частей на миллион и степенью разделения 2,0–2,5.
Анионообменные колонки в основном подходят для анализа анионных веществ, таких как органические кислоты и ионы галогенов; Колонки с сильными катионообменниками обладают более высокой ионообменной емкостью и селективностью и подходят для разделения и анализа сложных проб.
Вышеизложенное представляет собой лишь введение в типы и области применения нескольких распространенных колонок для жидкостной хроматографии в сочетании с собственным опытом автора. В реальных приложениях используются и другие специальные типы хроматографических колонок, такие как хроматографические колонки с крупными порами, хроматографические колонки с мелкими порами, колонки для аффинной хроматографии, многорежимные хроматографические колонки, колонки для сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UHPLC), колонки для сверхкритической жидкостной хроматографии ( SFC) и т. д. Они играют важную роль в различных областях. Конкретный тип хроматографической колонки следует выбирать в зависимости от структуры и свойств пробы, требований к разделению и других целей.
Время публикации: 14 июня 2024 г.