Принципы и методы количественного анализа методом жидкостной хроматографии

Механизм разделения жидкостной хроматографии основан на различии сродства компонентов смеси к двум фазам.

В зависимости от различных неподвижных фаз жидкостная хроматография делится на жидкостно-твердую хроматографию, жидкостно-жидкостную хроматографию и хроматографию на связанных фазах.Наиболее широко используются жидкостно-твердая хроматография с силикагелем в качестве наполнителя и хроматография на связанной фазе с микрокремнеземом в качестве матрицы.

По форме неподвижной фазы жидкостную хроматографию можно разделить на колоночную хроматографию, бумажную хроматографию и тонкослойную хроматографию.По адсорбционной способности ее можно разделить на адсорбционную хроматографию, распределительную хроматографию, ионообменную хроматографию и гель-проникающую хроматографию.

В последние годы к системе жидкостной колоночной хроматографии была добавлена ​​система потока жидкости под высоким давлением, чтобы обеспечить быстрое течение подвижной фазы под высоким давлением и улучшить эффект разделения, поэтому высокоэффективная (также известная как жидкостная хроматография высокого давления) появился.

ЧАСТЬ
01 Принцип количественного анализа жидкостной хроматографии

Для количественной оценки на основе качественных стандартов требуются чистые вещества;

Количественное определение жидкостной хроматографии является относительно количественным методом: то есть количество аналита в смеси оценивается по известному количеству чистого стандартного образца.

ЧАСТЬ
02 Основа количественного определения с помощью жидкостной хроматографии

Количество измеряемого компонента (W) пропорционально значению отклика (A) (высоте пика или площади пика), W=f×A.

Количественный поправочный коэффициент (f): это константа пропорциональности формулы количественного расчета, а ее физический смысл — это количество измеряемого компонента, представленное значением отклика единицы (площадь пика).

Количественный поправочный коэффициент можно получить из известного количества стандартного образца и его значения отклика.

Измерьте значение отклика неизвестного компонента, а количество компонента можно получить с помощью количественного поправочного коэффициента.

ЧАСТЬ
03 Общие термины в количественном анализе

Проба (проба): раствор, содержащий аналит для хроматографического анализа.Делятся на стандартные и неизвестные образцы.

Стандарт: Чистый продукт с известной концентрацией.Неизвестный образец (неизвестно): Смесь, концентрацию которой необходимо проверить.

Вес образца: первоначальный вес испытуемого образца.

Разбавление: коэффициент разбавления неизвестного образца.

Компонент: хроматографический пик, подлежащий количественному анализу, то есть аналит, содержание которого неизвестно.

Количество компонента (количество): содержание (или концентрация) испытуемого вещества.

Целочисленность: вычислительный процесс измерения площади хроматографического пика с помощью компьютера.

Калибровочная кривая: линейная кривая зависимости содержания компонента от значения отклика, установленная на основе известного количества стандартного вещества и используемая для определения неизвестного содержания аналита.

ЧАСТЬ
04 Количественный анализ жидкостной хроматографии

1. Выберите хроматографический метод, подходящий для количественного анализа:

l Подтвердите пик обнаруженного компонента и добейтесь разрешения (R) более 1,5.

l Определить консистенцию (чистоту) хроматографических пиков тестируемых компонентов.

l Определить предел обнаружения и предел количественного определения метода;чувствительность и линейный диапазон

2. Постройте калибровочную кривую со стандартными образцами различной концентрации.

3. Проверить правильность и прецизионность количественных методов.

4. Используйте соответствующее программное обеспечение для управления хроматографией для сбора проб, обработки данных и составления отчетов о результатах.

ЧАСТЬ
05 Идентификация количественных пиков (качественных)

Качественно идентифицировать каждый хроматографический пик, подлежащий количественной оценке.

Сначала используйте стандартный образец для определения времени удерживания (Rt) хроматографического пика, подлежащего количественной оценке.Сравнивая время удерживания, найдите компонент, соответствующий каждому хроматографическому пику в неизвестном образце.Качественный хроматографический метод заключается в сравнении времени удерживания со стандартным образцом.Критерий Недостаточнодальнейшее подтверждение (качественное)

1. Стандартный метод сложения

2. Одновременно использовать другие методы: другие хроматографические методы (изменить механизм, например: использование разных хроматографических колонок), другие детекторы (КПК: сравнение спектров, поиск в библиотеке спектров; МС: масс-спектральный анализ, поиск в библиотеке спектров)

3. Другие инструменты и методы

ЧАСТЬ
06 Подтверждение количественной согласованности пиков

Подтвердить согласованность (чистоту) хроматографического пика.

Убедитесь, что под каждым хроматографическим пиком находится только один измеряемый компонент.

Проверка на влияние соэлюирующих веществ (примесей)

Методы подтверждения постоянства (чистоты) хроматографических пиков

Сравнение спектрограмм с фотодиодно-матричными (КПК) детекторами

Идентификация пиковой чистоты

2996 Теория угла чистоты

Количественные методы, обычно используемые в ЧАСТИ 07.

Метод стандартной кривой, разделенный на метод внешнего стандарта и метод внутреннего стандарта:

1. Метод внешнего стандарта: наиболее часто используется в жидкостной хроматографии.

Серию стандартных образцов известных концентраций готовили с использованием чистых образцов соединений, подлежащих тестированию в качестве стандартных образцов.вводится в колонку до значения отклика (площадь пика).
В определенном диапазоне существует хорошая линейная зависимость между концентрацией стандартного образца и значением отклика, а именно W= f×A, и строится стандартная кривая.

В тех же экспериментальных условиях введите неизвестный образец, чтобы получить значение отклика измеряемого компонента.По известному коэффициенту f можно определить концентрацию измеряемого компонента.

Преимущества метода внешнего стандарта:простота эксплуатации и расчета, это широко используемый количественный метод;нет необходимости обнаруживать и элюировать каждый компонент;требуется стандартный образец;условия измерения стандартного образца и неизвестного образца должны быть одинаковыми;объем инъекции должен быть точным.

Недостатки метода внешнего стандарта:Условия эксперимента должны быть высокими, например, чувствительность детектора, скорость потока и состав подвижной фазы не могут быть изменены;объем каждой инъекции должен иметь хорошую повторяемость.

2. Метод внутреннего стандарта: точный, но хлопотный, чаще всего используется в стандартных методах.

К стандарту добавляют известное количество внутреннего стандарта для получения смешанного стандарта и готовят серию рабочих стандартов известной концентрации.Молярное соотношение стандарта и внутреннего стандарта в смешанном стандарте остается неизменным.Введите в хроматографическую колонку и примите (площадь пика стандартного образца/площадь пика внутреннего стандарта) в качестве значения отклика.По линейной зависимости между величиной отклика и концентрацией рабочего стандарта, а именно W= f×A, строят стандартную кривую.

К неизвестному образцу добавляется известное количество внутреннего стандарта и вводится в колонку для получения значения отклика измеряемого компонента.По известному коэффициенту f можно определить концентрацию измеряемого компонента.

Характеристики метода внутреннего стандарта:Во время операции образец и внутренний стандарт смешиваются и вводятся в хроматографическую колонку, поэтому, пока соотношение количества измеряемого компонента и внутреннего стандарта в смешанном растворе остается постоянным, изменение объема образца не повлияет на количественные результаты..Метод внутреннего стандарта компенсирует влияние объема образца и даже подвижной фазы и детектора, поэтому он более точен, чем метод внешнего стандарта.

ЧАСТЬ
08 Факторы, влияющие на результаты количественного анализа

Низкая точность может быть вызвана:

Неправильная интеграция площади пика, разложение пробы или примеси, попавшие во время подготовки пробы, негерметичная пробирка с пробой, испарение пробы или растворителя, неправильная подготовка пробы, проблемы с вводом пробы, неправильная подготовка внутреннего стандарта.

Возможные причины низкой точности:

Неправильная интеграция пиков, проблемы с вводом или инжектором, разложение пробы или примеси, попавшие во время подготовки пробы, хроматографические проблемы, ухудшенный отклик детектора.